Terapia génica para cáncer de pulmón por medio de silenciamiento génico

Introducción

El cáncer de pulmón es una enfermedad que causa una gran cantidad de muertes; a pesar de que ha habido mejoras en el diagnóstico y tratamiento, continúa siendo uno de los cánceres que más muertes provoca. Se asocia al tabaquismo y también puede ocurrir en fumadores pasivos. (Lee y otros, 2013)

El silenciamiento por RNA de interferencia (iRNA) es un mecanismo de silenciamiento génico post-transcripcional por RNA de doble cadena (dsRNA). (Hannon, 2002). Este evento ocurre naturalmente en la célula, dentro del núcleo, por medio de miRNA, o fuera de la célula por medio de infección viral, transfección, etc. También puede ser inducido para reducir o inactivar algún gen por medio de siRNA, que son dsRNA diseñados para secuencias específicas que se quieren estudiar. Dicho silenciamiento ocurre al introducir el siRNA diseñado para que, al instante en que entre a la célula, comience el proceso de silenciamiento por medio de diversas proteínas como Dicer y el complejo RISC. (Judge y otros, 2009)

Esta técnica se ha hecho famosa para diversos estudios de activación e inactivación de genes, y ha abierto un nuevo panorama con la llamada terapia génica, ya que el uso de iRNA puede ser una poderosa herramienta biomédica para el tratamiento de enfermedades que hasta el momento son incurables. (Chang, Kim, Dua, Kim, Lee, & Dong-ki, 2011)

En el cáncer de pulmón, específicamente en el tipo de células no pequeñas (NSCLC), el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) tiene un gran papel, debido a que este receptor modula la proliferación y crecimiento neoplásico por traducción de señales. Cuando hay una sobreexpresión de este receptor, comúnmente aparece presencia de tumores, según varios estudios. (Lee y otros, 2013)

Este factor es importante, ya que cuando sufre una mutación promueve el crecimiento continuo de las células; por lo que, si hay presencia de cáncer, favorecerá la invasión a órganos cercanos a los pulmones y complicará el tratamiento.

El proceso de silenciamiento génico por siRNAs puede ser utilizado para la inactivación del gen del EGFR cuando tiene una mutación, ya que este fenómeno causa que las células continúen creciendo, alterando su ciclo y favoreciendo el crecimiento de células tumorales. La terapia génica es una alternativa posible para este tipo de enfermedades, y el cáncer de pulmón es una de las que más muertes causa en todo el mundo.

Se han realizado estudios donde se ha demostrado una disminución de la proliferación de células tumorales en ratones mediante siRNA que inhiben al EGFR, por lo que se considera como un tipo de terapia con mucho futuro. (Judge y otros, 2009)

Sin embargo, un problema que con los años se ha ido incrementando y que se percibe como una amenaza es que hay parte de la población que puede presentar cáncer de pulmón sin historial de tabaquismo. Esto se presenta debido a mutaciones en receptores como EGFR y KRAS. Las mutaciones pueden ocurrir por muchos factores, y es común que una persona esté predispuesta por factores ambientales, por ejemplo si es fumador pasivo, historial familiar, entre otros. (Gaughana, Cryerb, Yeapc, Jackmanb, & Costa, 2013)

Estadísticas

El cáncer de pulmón denominado por sus siglas como CAP es responsable de la muerte de aproximadamente 1.4 millones de personas en el mundo al año (Milenio, 2012), representando una mayor prevalencia en países ubicados en América del Norte (El Universal, 2011). De acuerdo con datos publicados por la OMS, el cáncer es una de las primeras causas de muerte en el mundo, siendo el cáncer de pulmón uno de los más letales junto con el de estómago, hígado, colon y mama.

En México cada año se diagnostican 10 mil casos de la enfermedad; según el Instituto Nacional de Cancerología (INCAN), el cáncer se diagnostica en etapas avanzadas. El INCAN, ubicado en el Estado de México, registra anualmente la atención médica de 250 nuevos casos; sin embargo, el 90% de los pacientes fallece antes de los 18 meses de haberse diagnosticado la enfermedad. Solo el 7% sobrevive al menos 5 años después del diagnóstico (El Universal, 2011).

De acuerdo con el oncólogo Óscar Arrieta, coordinador de la Clínica de Cáncer de Pulmón y Cáncer de Tórax en el INCAN, el cáncer de pulmón representa el 18% de todas las muertes atribuidas al cáncer, y el 13% del total de cánceres registrados son de pulmón (El Universal, 2011). La incidencia se presenta tanto en mujeres como en varones; no obstante, el porcentaje es mayor en estos últimos. Representa la segunda causa de muerte en varones y la octava en mujeres, según el reporte GLOBOCAN de la OMS en 2008 (Pfizer, 2012).

Uno de los factores de riesgo que potencializa la posibilidad de padecer CAP es el tabaquismo, al que se le atribuye el 71% de las muertes (OMS, 2013). Principalmente porque se han identificado alrededor de 50 carcinógenos en el humo del tabaco (Milenio, 2012). El tabaquismo confiere a las mujeres el doble de probabilidades de desarrollar cáncer de pulmón que a los varones, lo que sugiere mayor susceptibilidad en las mujeres, según lo expresado por el oncólogo Óscar Arrieta (Milenio, 2012).

La edad en la que mayormente se presenta la enfermedad es en personas mayores; se considera que 8 de cada 10 casos de cáncer se presentan en personas de 60 años o más (Milenio, 2012). De acuerdo con estimaciones actuales, tomando como referencia el número de casos mundiales registrados de cáncer de pulmón, se estima que para 2025 la cifra de diagnósticos aumentará a 3.5 millones de personas en países desarrollados (Pfizer, 2012).

Desarrollo

En la actualidad los tratamientos contra el cáncer de pulmón son cirugía, quimioterapia, terapia de radiación o alguna combinación de las anteriores. Por ello se han buscado formas de tratar a los pacientes con métodos menos agresivos, dado que los anteriormente mencionados afectan al propio organismo o son invasivos.

En Estados Unidos y en Japón se aprobó el uso de gefitinib para el cáncer de pulmón de células no pequeñas, ya que es un inhibidor de la tirosina quinasa de este receptor; por la mutación, el receptor se desactiva controlando el crecimiento de las células. (Paez y otros, 2004).

También existe el medicamento erlotinib, que actúa asimismo como inhibidor de la tirosina quinasa del EGFR. Se ha comprobado que las mutaciones son en su mayoría una deleción en el exón 19 y la sustitución del aminoácido leucina por arginina en el codón 858. Estas dos mutaciones representan el 85-90% de todas las mutaciones en el EGFR. (Tabara, K., et al., 2012)

A pesar de esto, aún no hay terapias dirigidas hacia algunos receptores, únicamente para ciertos iniciadores más comunes de carcinogénesis de pulmón, como el mutante KRAS. Las mutaciones en KRAS conforman el 20-25% del cáncer de pulmón de células no pequeñas. (Gerner, 2011)

Pocos años después se comenzó a hacer uso de siRNAs para el tratamiento de enfermedades del pulmón, ya que ejercen un efecto biológico al guiar la degradación de la secuencia de su mRNA conjugado, bloqueando la producción de proteínas (silenciamiento génico por RNA de interferencia o iRNA). Debido a esta propiedad, los siRNAs se perfilaron como prometedores agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades hereditarias y adquiridas, así como herramientas de investigación para esclarecer la función de genes en salud y enfermedad. Dada su letalidad y prevalencia, las enfermedades pulmonares atrajeron especial atención como objetivos de curas mediadas por siRNA.

Aunado a esto, el pulmón puede ser accesible a agentes terapéuticos a través de múltiples rutas, por ejemplo por la nariz y la boca, evitando así la necesidad de focalización, por lo que es un objetivo atractivo para estrategias terapéuticas basadas en iRNA. Sin embargo, el éxito clínico de las intervenciones por siRNA depende críticamente de la seguridad y eficacia de los métodos de administración y agentes utilizados. La introducción de siRNAs correspondientes a enfermedades del pulmón se intentó mediante infección con el virus de la influenza por vía intravenosa y respiratoria en monos y ratones, obteniendo resultados favorables pero no óptimos; por ello se consideró que el estudio de esta tecnología era prometedor para las terapias del futuro. (Thomas et al., 2007)

Posteriormente se realizaron diversos análisis del efecto terapéutico del silenciamiento génico por iRNA sobre cáncer de pulmón. Para ello se efectuaron pruebas experimentales in vitro sobre la línea celular A549, donde se silenció el receptor del factor de crecimiento “insulin-like” tipo I (IGF-IR), el cual se sobreexpresa en cáncer (incluido cáncer de pulmón) y modula la proliferación de células cancerígenas y el crecimiento de tumores. Se utilizó el promotor humano U6 de DNA molde para inducir horquillas de RNA (hpRNA) accionadas al iRNA para silenciar la expresión génica de IGF-IR y después se evaluaron sus efectos sobre la apoptosis, la apoptosis relacionada con la expresión génica y el crecimiento tumoral in vitro. Con esto se logró la reducción de la expresión de IGF-IR en más del 78.9%, el incremento de la activación de caspasa-3, de la apoptosis y la inhibición del crecimiento de las células A549 in vitro.

Así mismo se analizó el efecto in vivo, realizando la inyección directa de plásmidos de DNA (expresando hpRNA para IGF-IR) sobre tumores cancerígenos en ratones desnudos, donde se encontró la reducción de los tumores ya establecidos. Con estos resultados se reafirmó el potencial del iRNA como método de terapia génica para tratar cáncer pulmonar (Dong et al., 2007). Otros estudios in vivo se realizaron en ratones en los que se hizo el knockdown de la expresión génica de señales transductoras y activadoras de la transcripción 3 (STAT3) con siRNA sobre pulmones con cáncer de Lewis transplantados. (Wang et al., 2008)

Se probaron múltiples estrategias para introducir el siRNA en el tratamiento del cáncer de pulmón, pues la introducción eficiente del siRNA en las células continuaba siendo un reto. Entre las que obtuvieron mejores resultados se encuentran las esferas compactas de un copolímero de baja densidad formado por chitosan-graft-polyethylenimina (CHI-g-PEI), las cuales mostraron una alta eficiencia de transfección de siRNA Akt1 con buena viabilidad celular in vitro e incluso in vivo vía aerosol, y mostraron un descenso significativo en el crecimiento de células cancerígenas.

En la Figura 1 se describe el proceso de silenciamiento in vitro utilizando el acarreador CHI-g-PEI, al que se adiciona una solución de siRNA para obtener complejos de 100 pmol de concentración de siRNA, con el fin de silenciar la proteína reportera EGFP (lo que desencadena fluorescencia) y el oncogen Akt1. Con esto se logró incrementar los niveles de apoptosis y disminuir la proliferación de células cancerígenas de pulmón, por lo que se consideró a CHI-g-PEI como un buen medio transfectante para siRNA; sin embargo, la formación del complejo es complicada debido a la rigidez de la molécula y a su carga aniónica limitada. (Jere et al., 2009)

Recientes estudios han manifestado que los tratamientos con gefitinib y erlotinib, conocidos por sus siglas en inglés como EGFR-TKIs (tyrosine kinase inhibitors), han generado una buena respuesta en pacientes; sin embargo, en muchos casos el tratamiento ha resultado ineficiente, porque las células desarrollan resistencia al fármaco tras recibirlo por un periodo prolongado (Shien, K., y otros, 2012).

Una nueva forma de tratar el cáncer de pulmón, principalmente de células no pequeñas, según estudios publicados por científicos de Japón (2012), es mediante el uso de siRNAs para el silenciamiento (knockdown) del gen que codifica para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (Shien, K., y otros, 2012).

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es una glicoproteína transmembranal con un peso molecular de 170 000 a 180 000 que se caracteriza por tener varios dominios. (Min, Z., y otros, 2005). Estos dominios incluyen el primero, extracelular de unión a ligando, que promueve respuestas celulares dirigidas a la proliferación; el segundo, de transmembrana, que ancla el receptor a la membrana; y finalmente el dominio citoplasmático tirosina quinasa, que origina la transducción de señales (De la Cruz, J., 2007). El EGFR es activado por unión con ligandos específicos como EGF y transforming growth factor α (TGF-α), considerados los más importantes, a los que se suman HB-EGF, amphiregulina, betacelulina, epiregulina y las neuregulinas 1-4. Sin embargo, no se conoce un ligando activador directo, lo que complica el desarrollo de una técnica específica para su silenciamiento. Este ligando propicia la actividad intracelular de proteínas quinasas; por consiguiente, se produce la autofosforilación de varios residuos de tirosina en el extremo carboxilo terminal. Al fosforilarse estos residuos se activa una cascada de señalización que modula la síntesis de DNA y la proliferación celular. Las rutas activadas más importantes son MAPK, Akt y JNK. Estas proteínas modulan la migración, adhesión y motilidad celular, principales blancos de las mutaciones observadas en cáncer. Por ello este receptor se ha convertido en un objetivo clave para el desarrollo de tratamientos.

Según el estudio de Shien y colaboradores, al realizar silenciamiento con siRNAs dirigidos a diferentes regiones; siEGFR-1 (5’-GCUACGAAUAUUAAACACUUC-3’ y 5’-AGUGUUUAAUAUUCGUAGCAU-3’) y siEGFR-2 (5’-CCGCAA AUUCCGAGA CGAAGC-3’ y 5’-UUCGUCUCGGAAUUUGCGGCA-3’) en células tumorales resistentes a EGFR-TKI, se observó represión total del p-EGFR (EGFR fosforilado) excepto en la línea celular NCI-H1650. Por ello se considera el silenciamiento génico por siRNAs dirigidos al EGFR como un tratamiento potencial del NSCLC cuando el EGFR está activado, incluso en pacientes con resistencia a EGFR-TKI (Shien y otros, 2012).

Investigaciones sobre EGFR incluyeron la amplificación y secuenciación de los exones que codificaban para los bucles de activación de 47 de 58 receptores humanos de quinasas (Paez y otros, 2004). Se analizaron secuencias extraídas de DNA genómico de 58 muestras de pacientes con cáncer, incluidas 41 de adenocarcinomas de pulmón. Se detectaron mutaciones heterocigotas en EGFR en tres de las muestras al compararlas con tejido pulmonar sano.

Posteriormente se examinaron los exones 2 a 25, importantes para la codificación de proteínas del EGFR, presentes en los exones 18 a 31 del dominio quinasa. Se observaron deleciones múltiples de nucleótidos al comparar tejido sano contra tejido enfermo. Los pacientes con estas mutaciones obtuvieron la respuesta más significativa a la droga gefitinib.

Finalmente, se determinó la eficacia del tratamiento con gefitinib en un grupo de pacientes: de cinco pacientes que respondieron al tratamiento, cuatro mejoraron durante el mismo. El análisis estadístico mostró que los pacientes con las mutaciones mencionadas tuvieron hasta 50 veces más sensibilidad al tratamiento que los que no las presentaban.

Aunque existe información sobre terapia génica para la inhibición de este receptor, el panorama aún es complejo, pues queda por determinar un vehículo para la entrega de ácidos nucleicos lo suficientemente potente y viable en humanos. Los ensayos se enfocaron principalmente en el efecto de siRNAs usando moléculas de dsRNA; sin embargo, in vivo se observó una expresión baja y un efecto limitado en el tejido. Es necesario mejorar el método de entrega de las cadenas de RNA para silenciamiento, mediante una técnica que permita una alta tasa de expresión y un efecto más potente.

Se ha propuesto el vector JDV de la enfermedad del virus de Jembrana bovina, que ha demostrado capacidad de entrega de genes tanto en etapas activas del ciclo celular como en etapas sin actividad. Dicho vector permite la entrega del dsRNA dirigido al EGFR llamado pjLPIIIRE y se utilizó en líneas A549 y SPC-A1. Evaluando su efecto en ratones a 10 y 70 horas después de la infección se encontró que el 75% de las señales de A549 y el 80% de SPC-A1 se convirtieron en células EGFR negativas, lo que demostró el impacto positivo del iRNA dirigido a EGFR.

Actualmente los medicamentos mencionados (gefitinib y erlotinib) han ayudado a disminuir el crecimiento o el avance rápido del cáncer, y esta terapia ha sido aceptada por ser más eficiente que algunas quimioterapias y radioterapias. (Petrelli, Borgonovo, Cabiddu, & Barni, 2012)

A pesar de los avances, aún queda un largo camino para que la terapia génica pueda desarrollarse y comercializarse como un producto terapéutico clínico para el cáncer en humanos. También deben considerarse cuestiones éticas y el impacto genético que podría traer este tipo de tratamientos en el futuro.

Conclusión

A nivel mundial el cáncer de pulmón representa una de las principales causas de muerte. Los tratamientos actuales aún son insuficientes, por lo que es necesario continuar las investigaciones que aporten soluciones. La terapia génica es una línea científica con potencial para tratar este y otros problemas, pues presenta ventajas, por ejemplo, en trastornos genéticos podría reemplazar un gen no funcional por uno funcional, ofreciendo una oportunidad para una vida más normal.

Un paciente con cáncer podría beneficiarse mediante la inserción de vectores genéticamente modificados en el genoma humano. Dado que la terapia génica implica cambios en el funcionamiento de los genes, surgen cuestiones éticas y técnicas. Si se modifica la información genética de las células incorrectas existe el riesgo de que la información introducida pase a las células reproductivas y, por consiguiente, a la descendencia, con posibles consecuencias no deseadas.

Nuestro sistema inmunológico es muy efectivo defendiendo el cuerpo; cuando se introduce un nuevo gen por medio de un vector (por ejemplo un virus) existe el riesgo de que el organismo lo identifique como un agente maligno y lo ataque, lo que puede causar problemas de salud graves o incluso la muerte. Además, existen efectos secundarios a largo plazo que aún no se conocen.

A medida que avanzan los descubrimientos en terapia génica aumenta la posibilidad de contar con nuevos tratamientos para enfermedades que hoy no tienen cura; se estima que en un futuro no muy lejano la terapia génica resolverá muchos problemas que los tratamientos actuales no pueden.

Autores: Salvador Tovar López, Ian Luis Herrera Simpson, Paulina Lizet Franco Luna, José Alonso Ramos Aldana y Doddy Denise Ojeda Hernández.

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